基于免疫组织化学检测的分子病理诊断

来源：《中华病理学杂志》

作者：方茹，王小桐，夏秋媛，周晓军，饶秋（医院病理科）

　　本文经《中华病理学杂志》授权发布，其他媒体转载或引用须经《中华病理学杂志》同意，否则追究法律责任。

　　免疫组织化学是目前病理诊断过程中不可或缺的工具，其在肿瘤的良恶性鉴别、分化分型、起源判定以及微生物检测等方面发挥了重要作用。免疫组织化学本质是检测基因在其终产物蛋白质水平的表达情况，在提供肿瘤基因信息尤其是分子病理改变方面起着重要作用[1]。与分子病理检测相比，免疫组织化学检测耗费低，用时短，消耗人力少，应用于常规病理诊断更加快速便捷。我们总结能够反映分子病理改变，甚至替代分子病理诊断的相关免疫组织化学指标，并阐述其应用过程中存在的问题及注意事项。

　　免疫组织化学可检测到的肿瘤分子改变大致包括特异性染色体易位、基因突变、基因缺失、基因扩增和肿瘤相关性病毒感染。

　　一、采用免疫组织化学检测特异性染色体易位

　　越来越多特异性的染色体易位在肿瘤中被发现，并且形成融合基因，但并不是所有的融合基因都能被免疫组织化学方法检测到。以融合基因检测诊断肿瘤需要以下一系列条件：（1）融合基因在此肿瘤类型中高发；（2）相关基因产物有适宜抗体的应用；（3）目标基因由于易位而更换强启动子导致该基因高表达；（4）目标蛋白在正常组织中表达受限；（5）目标蛋白在其他肿瘤中不表达或者表达率低。

　　1.TFE3和TFEB易位的相关肿瘤：

　　TFE3和TFEB基因均属于同一个转录因子家族，该家族成员还包括MITF和TFEC。TFE3和TFEB易位的相关肿瘤已经为人们所认识，包括Xp11肾细胞癌、腺泡状软组织肉瘤、色素性Xp11易位性肿瘤/伴有色素分化的Xp11易位性肿瘤/TFE3易位性PEComa以及t（6；11）肾癌/TFEB易位肾癌[2,3,4]。染色体易位最终激活TFE3和TFEB蛋白高表达。因此，我们可以利用免疫组织化学方法检测TFE3和TFEB蛋白来诊断相关肿瘤[5,6]，其灵敏度和特异度分别达到97.5%和99.6%。也可以检测其下游的正向调控基因Cathepsink、HMB45和MelanA来对其进行诊断，但后者对于TFE3易位相关性肿瘤并不总是有效。TFE3和TFEB是一种转录因子，在正常组织中会有微弱表达，实际工作中不同的检测条件下往往会出现假阳性。根据我们的经验，当低倍镜下可见明确的细胞核阳性且内对照为阴性时，能可靠提示肿瘤存在TFE3或TFEB的基因易位（图1）。此外，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测融合基因需要知道准确的融合位点，且需要新鲜肿瘤组织，故不作推荐。荧光原位杂交（FISH）分离探针方法被认为灵敏度较高，但也有不足之处。当肿瘤为inv（X）（p11.2；q12）/NONO-TFE3或inv（X）（p11.2；p11.23）/RBM10-TFE3时，FISH分离探针结果容易被误判为阴性。inv（X）（p11.2；q12）/NONO-TFE3是位于X染色体短臂的TFE3基因和长臂的NONO基因发生了跨越着丝粒的转位。其FISH分离信号一般介于1到2个信号之间，因此不易判读（大于2个信号为阳性）。inv（X）（p11.2；p11.23）/RBM10-TFE3是位于X染色体短臂的TFE3基因和RBM10基因发生了在同一个短臂内的转位。其FISH分离信号更不能辨别出TFE3基因易位。此时结合形态和免疫组织化学特点对诊断尤为重要。

　　图1TFE3易位性肾癌，肿瘤细胞核TFE3阳性表达EnVision法高倍放大；

　　图2孤立性纤维性肿瘤，肿瘤细胞核STAT6呈强阳性表达EnVision法中倍放大；

　　图3正常的生发中心bcl-2呈阴性表达EnVision法中倍放大；

　　图4滤泡性淋巴瘤中，bcl-2在滤泡中心部位的阳性染色反映了bcl-2易位的存在EnVision法低倍放大；

　　图5套细胞淋巴瘤中cyclinD1阳性表达EnVision法中倍放大；

　　图6纤维瘤病，肿瘤细胞核β-catenin阳性表达EnVision法高倍放大；

　　图7胰腺实性假乳头状肿瘤中，肿瘤细胞核β-catenin阳性表达EnVision法中倍放大；

　　图8卵巢高级别浆液性癌中p53广泛的强阳性表达　EnVision法低倍放大；

　　图9高级别浆液性癌中p53染色完全缺失，同时内对照为阳性EnVision法高倍放大；

　　图10渐变型少突胶质瘤胞质IDH1强阳性EnVision法中倍放大；

　　图11弥漫型星形细胞瘤胞质IDH1强阳性EnVision法中倍放大；

　　图12乳腺小叶癌中肿瘤细胞胞质呈p阳性表达EnVision法中倍放大；

　　图13高分化脂肪肉瘤胞核MDM2强阳性EnVision法中倍放大；

　　图14脂肪肉瘤胞核CDK4强阳性EnVision法中倍放大；

　　图15霍奇金淋巴瘤中Reed-Sternberg细胞持续稳定地表达EBV-LMP1EnVision法高倍放大；

　　图16宫颈癌中肿瘤细胞核p16呈弥漫强阳性表达EnVision法中倍放大。

　　2.孤立性纤维性肿瘤：

　　是一种少见的间叶源性肿瘤，其诊断需要与诸多梭形细胞肿瘤鉴别。STAT是一组可以与靶基因调控区DNA相结合的新型转录因子家族，具有信号转导和转录激活因子双重功能，STAT6是该家族的一员。SFT的病因至今未明，随着分子生物学技术进展，新近有研究发现inv12（q13q13）NAB2-STAT6融合基因是SFT的一个重要驱动基因，SFT中存在高频的NAB2-STAT6基因融合，推测该融合基因可能是导致SFT发生发展的重要分子事件。基因测序、RT-PCR和免疫组织化学检测发现NAB2-STAT6融合基因可导致STAT6强的核信号表达（图2），免疫组织化学与基因测序结果具有高度一致性，阳性率高达98%，STAT6免疫组织化学染色能够可靠地替代NAB2-STAT6融合基因的检测。

　　3.滤泡性淋巴瘤：

　　它特征性存在t（14；18）（q32；q21）易位和bcl-2基因重排，发生率高达70%～90%。这种易位导致了bcl-2蛋白在瘤细胞中过度表达。虽然bcl-2在正常的淋巴细胞中广泛表达，但是bcl-2并不表达于正常的生发中心（图3）。因此，bcl-2在滤泡中心部位的阳性染色（阳性率83%～91%）反映了bcl-2易位的存在，支持滤泡性淋巴瘤的诊断（图4）。此外，有时易位的bcl-2基因会发生突变，从而造成滤泡性淋巴瘤bcl-2蛋白阴性染色。这种情况下可以更换其他克隆的bcl-2抗体（如E17）来帮助诊断[7]。检测滤泡性淋巴瘤bcl-2基因易位的各种方法中，免疫组织化学的灵敏度与FISH的灵敏度相当，但比PCR的灵敏度要高。

　　4.套细胞淋巴瘤：

　　93%以上的套细胞淋巴瘤过度表达cyclinD1（由CCND1基因编码），而正常的淋巴细胞不表达。因此套细胞淋巴瘤可以通过cyclinD1的免疫组织化学来诊断（尤其是用兔单克隆抗体；图5）。在检测t（11；14）（q13；q32）的各种方法中，免疫组织化学灵敏度最高，阳性率50%～60%。而RT-PCR检测CCND1-IGH基因融合的阳性率25%～50%，其灵敏度及特异度与FISH相当。cyclinD1很少在其他类型淋巴瘤中见到，偶尔见于慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤或浆细胞瘤，极少的弥漫性大B细胞淋巴瘤表达cyclinD1。

　　5.间变性淋巴瘤激酶（ALK）易位的相关肿瘤：

　　许多肿瘤以染色体2p13位点上的ALK基因易位为特点，其中包括间变性大细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、炎性纤维母细胞瘤、ALK阳性肺腺癌，发生于5%～7%的病例[8]。极少数甲状腺癌、乳腺癌和肾细胞癌也可发生。除了少数中枢神经细胞，ALK蛋白在正常细胞中并不表达。ALK基因重排导致ALK蛋白的表达激活，因此ALK的免疫组织化学阳性可以推断存在ALK基因易位。此外，ALK的表达模式和ALK融合伴侣有关。EML4-ALK、TPM3-ALK、TPM4-ALK、CARS-ALK、ATIC-ALK和SEC31L1-ALK融合类型的肿瘤中，ALK在胞质中表达。CLTL-ALK融合类型的ALK呈颗粒状胞质阳性。RANBP2-ALK融合类型的ALK位于核周或核膜阳性[8]。ALK的免疫组织化学检测比RT-PCR更加方便，其灵敏度和特异度与FISH相似。

　　二、采用免疫组织化学检测肿瘤的基因突变

　　许多肿瘤具有特异的驱动基因突变，一些可以通过免疫组织化学来验证，其结果可提供诊断线索。

　　1.基因突变导致信号蛋白表达异常定位：

　　β-catenin（CTNNB1）基因在一部分肿瘤中发生突变，如结直肠腺癌、未分化甲状腺癌、筛状-桑葚状亚型甲状腺乳头状癌、胰腺实性假乳头状瘤、肝细胞腺瘤和韧带样纤维瘤（纤维瘤病）。β-catenin的正常表达定位于细胞膜，然而β-catenin基因或者其Wnt信号通路基因（如APC基因）的突变可导致β-catenin蛋白在细胞核异常聚集[1]。β-catenin的细胞核免疫染色可以帮助诊断以下疾病：（1）结直肠腺癌和卵巢、子宫以及膀胱腺癌的鉴别[9]；（2）纤维瘤病和其他梭形细胞病变鉴别[10]（图6）；（3）筛状-桑葚状亚型甲状腺乳头状癌的确诊[11]；（4）胰腺实性假乳头状肿瘤同胰腺其他内分泌肿瘤的鉴别[12]（图7）；（5）肝细胞腺瘤的诊断[13]。

　　2.基因突变导致蛋白稳定性增强：

　　p53基因突变在许多类型的肿瘤中均有发生，然而该突变也可以发生在一些肿瘤的早期阶段，如女性生殖道的高级别浆液性癌以及溃疡性结肠炎相关的发育异常。因此，p53检测可以帮助疾病的诊断或分类。p53弥漫强阳性通常意味着p53基因突变，而其局灶弱阳性表达多与非突变事件引起的野生型p53聚集有关。浆液性癌和子宫内膜上皮内癌通常表现为广泛的强阳性（图8），然而部分正常组织、子宫内膜样癌和透明细胞癌常表现出弱阳性或者片状中等阳性[14]。文献对于p53突变以及p53免疫组织化学阳性判读的关联性有争议，目前认为如果以肿瘤细胞大于60%的广泛阳性作为强阳性标准，p53突变与p53免疫组织化学阳性具有很高的一致性。如p53在肿瘤中染色完全缺失，但内对照为阳性染色（正常细胞弱到中等阳性）也可以暗示p53基因突变（图9）。这主要是由于一些p53的截短突变不被p53的抗体所识别。因而浆液性癌中p53呈现一种“全有/全无”的表达形式。

　　3.特异性突变抗体：

　　一些特异性突变抗体可以结合在突变基因编码的突变蛋白区域，因此，其免疫组织化学阳性染色反映了目标基因特异性突变的存在。这类抗体在未来将会越来越多，并应用于病理诊断。（1）异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）RH：在Ⅱ或Ⅲ级神经胶质瘤中（包括星形胶质瘤和少突胶质瘤），IDH1基因的杂合突变是最常见的突变形式（约70%；图10），而在其他原发性脑肿瘤中很少见[15]。在90%以上的IDH1突变病例中，核苷酸第位点腺嘌呤代替了鸟嘌呤，从而在第位点（RH）上组氨酸代替了精氨酸。一种可以检测IDH1-RH蛋白突变的单克隆抗体（克隆号H09）可以用来证明胶质瘤中IDH1基因突变[16]，主要的应用包括：①预测胶质母细胞瘤患者的预后；②区分胶质瘤（阳性）和胶质细胞增生（阴性）；③根据肿瘤边缘以及治疗后病变位点的活检标本，判断胶质瘤的累及情况[17]（图11）。此外，IDH1和IDH2基因突变也好发于软骨肿瘤，主要是IDH1RC的突变，而不是RH[18]。该特异性突变抗体对鉴别软骨肉瘤和软骨母细胞型骨肉瘤很有帮助。（2）BRAFVE位点的突变：BARF突变主要发生在甲状腺乳头状癌、黑色素细胞痣、恶性黑色素瘤、低级别浆液性腺癌、卵巢交界性浆液性肿瘤、毛细胞白血病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症和后肾腺瘤中[19]，特异性突变抗体可以检测到BRAF中最常见的VE位点突变，它仅可以检测到携带突变的细胞，但是不能检测到没有突变的细胞。许多研究均显示免疫组织化学染色与BRAF突变之间有着良好的一致性[20,21]。

　　三、采用免疫组织化学检测基因失活或者功能缺失

　　抑癌等关键基因失活是肿瘤形成的关键机制，而关键基因功能的缺失可能是由于基因的失活突变、丢失或者启动子甲基化，这些情况均可以通过免疫组织化学来检测。

　　1.微卫星不稳定性大肠癌的错配修复蛋白：

　　遗传性非息肉性结直肠癌综合征（HNPCC）包括早发性结直肠癌和其他一些癌症如子宫内膜样癌，其特点是患者具有错配修复基因（如MLH1、MSH2、MSH6或PMS）胚系突变。错配修复基因缺陷导致了微卫星不稳定（MSI）的结直肠癌亚型。一小部分散发性结直肠癌也可表现MSI。存在MSI的结直肠癌比没有MSI的结直肠癌预后要好。错配修复蛋白免疫组织化学是否缺失是证实错配修复基因功能状态的一种快速方法。值得注意的是，在结直肠癌中错配修复蛋白的缺失并不能鉴别HNPCC相关性肠癌和散发性MSI阳性的肠癌。HNPCC的确诊需要分子病理检测错配修复基因是否存在胚系突变。在功能状态下，错配修复蛋白形成二聚体，MLH1（优势方）与PMS2配对，而MSH2（优势方）与MSH6配对。二聚体中优势方（MLH1或MSH2）的突变会导致二聚体中所有成分降解。然而，当非优势蛋白（PMS2或MSH6）发生突变时，这样的情况就不会发生，因为非优势蛋白的功能会被其他蛋白所取代。因此，MLH1或MSH2的突变常会引起MLH1/PMS2或MSH2/MSH6功能的同时缺失，然而PSM2或MSH6突变常引起单独的PMS2或MSH6功能的缺失[22]。一些MLH1和MSH6较为频发的错义突变，并不会影响蛋白质翻译、稳定性和抗原性。在这些情况下，MSI可以帮助鉴别。因此在评估HNPCC的过程中，错配修复蛋白免疫组织化学可以与分子MSI检测综合应用，以确定具体的功能缺失基因[5]。

　　2.E-cadherin与乳腺小叶癌：

　　乳腺小叶癌的主要特点就是E-cadherin缺失导致细胞间黏附性下降。E-cadherin（CDH1）表达缺失可能有以下几种机制：（1）CHD1基因失活或者截短突变；（2）CDH1启动子甲基化；（3）CDH1转录失活。因此，可以通过E-cadherin抗体的免疫组织化学染色缺失来诊断反映不同类型的分子改变，鉴别浸润性小叶癌（阴性）和浸润性导管原位癌（阳性）、小叶原位癌（阴性）和导管原位癌（阳性）、非特异性小叶增生（阳性）及多形性小叶癌[23]。约16%以上的小叶癌E-cadherin表现为阳性，这可能是由于伴有抗原决定簇完整的错义突变所致。在这种情况下，还可以行p-catenin免疫组织化学染色。肿瘤细胞表现为弥漫性胞质染色而不是膜染色时诊断为小叶癌[24]。正常情况下，p-catenin结合在E-cadherin分子的亚质膜部分，因此免疫组织化学染色定位于细胞膜。E-cadherin功能失常，p-catenin释放到胞质中，导致异常的弥漫性胞质染色（图12）。

　　3.琥珀酸脱氢酶（SDH）相关肿瘤：

　　SDH相关的遗传性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤综合征是一种常染色体显性遗传疾病，患者可能会发展为副神经节瘤、胃肠道间质瘤以及肾细胞癌。它以SDH基因的胚系突变为特点，SDH包含了4个亚基SDHA、SDHB、SDHC和SDHD，任意1个亚基的突变都会导致SDH蛋白复合物的不稳定以及SDHB蛋白降解，表现为SDHB蛋白免疫表达缺失。SDHB的免疫组织化学可以反映任何SDH亚基的突变，为鉴别SDH突变的肿瘤提供了一个既敏感又特异的方法，而SDHA免疫组织化学表达缺失只反映SDHA亚基的突变。利用这2种抗体可以有效识别SDH缺陷相关性肿瘤。但在免疫组织化学判读为阴性时，一定要以阳性内对照（血管内皮细胞、炎性细胞等）为参照，否则不能轻易判读为缺失表达。

　　四、采用免疫组织化学检测基因扩增

　　基因的扩增经常导致编码蛋白的过表达。免疫组织化学对基因扩增的评估更具主观性。因为染色强度可以被多种技术因素所影响，例如固定时间、抗原修复的强度以及免疫组织化学检测系统的灵敏度等。

　　1.乳腺癌中HER2的扩增：

　　将近20%的乳腺癌表现出HER2基因的扩增。HER2的扩增与患者较差的预后相关，并且对内分泌治疗有一定的抵抗性。然而，抗HER2的靶向治疗（trastuzumab）可以针对HER2扩增的患者产生不错的疗效。由于免疫组织化学染色和分子改变之间有着较紧密的关系，为了筛选靶向治疗的乳腺癌患者，HER2蛋白的免疫组织化学检测是运用最广泛的筛查或诊断工具[26]。整个检测流程包括标本固定、取材、试剂的应用及最终检测判读，有严格的判读和质控标准。为此相关专家形成共识并发表了中国乳腺癌HER2检测指南[27]，并就不断遇到的新问题予以更新。

　　2.高分化脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤和低级别骨肉瘤中12q12-15的扩增：

　　高分化脂肪肉瘤与脂肪瘤很难鉴别，尤其是在活检标本中。去分化脂肪肉瘤与其他类型的肉瘤也常常难以鉴别。这2种形态的脂肪肉瘤的细胞遗传学以染色体形成额外的环形结构以及染色体12q14-15区域形成多个拷贝为特点。许多不同的基因都定位在这个区域，如CDK4和MDM2。在高分化/去分化脂肪肉瘤的诊断中，免疫组织化学染色高表达CDK4和MDM2是一种有效的辅助诊断方法。CDK4的灵敏度和特异度分别是68%～86%及88%～89%，而MDM2分别为86%～%及59%～74%[27]。高分化的中央型骨肉瘤和骨旁骨肉瘤都以12q14-15位点的扩增为特点[28]。在这些低级别骨肉瘤中，MDM2的阳性率在70%，而CDK4的阳性率为87%。这2个标志物中至少有1个阳性的几率是%，而2个都阳性的几率是57%。其染色强度在大多数病例中是弥漫性、中等或者强阳性（图13，图14），而良性病变通常为阴性表达，因此，在与良性病变的鉴别诊断中，MDM2以及CDK4的免疫组织化学是一种有效的辅助手段[29]。

　　五、采用免疫组织化学检测肿瘤相关性病毒

　　1.Epstein-Barr病毒（EBV）：

　　与多种肿瘤有关，包括淋巴瘤、淋巴上皮癌以及间叶肿瘤。肿瘤中EBV相关的基因及其蛋白随着EBV潜伏类型的不同而变化[30]。EBV的检测可以帮助肿瘤诊断及分型，最可靠的检测方法就是原位杂交检测EBV编码RNA（EBER），但是免疫组织化学更加简便易行，在EBV检测中也具有重要的价值。应用最广泛的抗体是抗EBV-LMP1抗体。EBV潜伏模式各不相同，理论上讲除了Burkitt淋巴瘤（Ⅰ型潜伏），EBV-LMP1免疫组织化学可以检测到所有类型潜伏（Ⅱ型和Ⅲ型）EBV相关肿瘤中的病毒。但是事实并不是这样，EBV-LMP1在EBV相关肿瘤中的表达水平经常较低，以至于不能被常规免疫组织化学检测[31]。因此，EBV-LMP1免疫组织化学出现阴性结果时也不能排除EBV感染。但对于EBV相关的经典霍奇金淋巴瘤，其R-S细胞持续稳定地表达EBV-LMP1（图15）。因此，除了霍奇金淋巴瘤，EBV-LMP1的免疫组织化学并不能替代EBER原位杂交[32]。EBV核抗原2（EBNA2）的免疫组织化学可以有效地检测Ⅲ型潜伏相关肿瘤中的EBV。但是，其他一些EBV相关肿瘤（如移植后的淋巴组织异常增殖和老年人EBV阳性的大B细胞淋巴瘤）也可以表现出Ⅱ型或Ⅲ型的EBV潜伏类型。因此，EBNA2的阴性染色不能排除EBV的存在。

　　2.人类乳头状病毒（HPV）相关肿瘤：

　　HPV和人类皮肤、消化道、生殖道的多种良恶性病变相关，包括各种病毒疣、宫颈阴道的上皮内瘤变、宫颈鳞癌腺癌、食管鳞癌等[33]。检测HPV可以帮助区分宫颈腺癌（HPV阳性）和子宫内膜腺癌（HPV阴性），此外HPV阳性的食管鳞癌预后好于HPV阴性的食管鳞癌。HPV免疫组织化学检测的是HPV衣壳抗原，在这个阶段病毒进入细胞核呈游离形式，并复制形成病毒颗粒（包括衣壳）。病毒的这种状态通常存在于良性或低级别鳞状上皮瘤变中，这种HPV抗体并不能反映HPV已经整合入宿主基因组。而这种整合入宿主基因组的感染通常出现在高级别上皮内瘤变和癌症当中。HPV整合宿主基因组需要DNA原位杂交或检测E6/E7mRNA。p16是一种周期依赖性激酶抑制剂，受RB蛋白调控。正常情况下RB蛋白抑制p16转录，但在HPV感染情况下，其E6和E7蛋白使RB蛋白失活，导致p16过表达。p16可以作为代理用来检测高危HPV感染[34]。但这种应用仅限于确实存在高感染率的宫颈癌（图16）和食管癌。口腔、喉、鼻咽癌及卵巢子宫浆液性癌HPV感染率低，虽然p16可以阳性，但并不能反映高危HPV感染[35]。其他潜在的调控机制也可以造成p16阳性[36]。p16尚可用于高级别鳞状上皮内瘤变与低级别鳞状上皮内瘤变的鉴别诊断，前者90%以上p16呈弥漫强阳性，后者阳性表达率低，呈散在局灶弱阳性表达。值得注意的是，子宫内膜异位和输卵管子宫内膜化生病灶p16也可以阳性。此外，对于肺和食管同时出现的鳞状细胞癌，p16有助于区别肿瘤是双原发还是食管单发伴转移。

　　随着免疫组织化学和肿瘤分子病理研究进展，免疫组织化学在为肿瘤提供基因信息方面扮演着日益重要的角色，在分子病理诊断中的应用已日趋成熟。随着时间的推移，越来越多的免疫组织化学指标将被运用到分子病理诊断中，并指导更精准的肿瘤分型，从而为治疗提供依据。

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